**Benoit Limoges et Damien Marchal
Université Paris Diderot/CNRS, Laboratoire d’Electrochimie Moléculaire
Conception et réalisation d’un instrument de PCR en temps réel avec détection électrochimique

Détecter, quantifier et analyser l’ADN d’une cible biologique (bactérie, virus, cellule, …) est un enjeu majeur dans de nombreux domaines des sciences du vivant.

Parmi les différentes méthodes de détection d’ADN, les techniques de PCR en temps réel, couplant amplification exponentielle d’acides nucléiques in vitro et détection par fluorescence, sont connues pour être les plus rapides (< 2h), sensibles (détection de quelques copies d’un ADN viral dans un échantillon biologique complexe), spécifiques (mise en évidence d’une mutation) et simples d’utilisation (une seule étape). Mais en raison de la mise en œuvre d’une détection optique par fluorescence (permettant ainsi de suivre in situ la réponse de marqueurs fluorescents), ces dispositifs analytiques souffrent d’un coût d’acquisition instrumental élevé, mais aussi d’une maintenance et utilisation onéreuse. Par ailleurs, de par leur conception, ils s’avèrent difficilement transportables.

Pour remédier à ces inconvénients, nous avons imaginé, conçu puis développé un dispositif (prototype) de PCR en temps réel reposant sur une détection électrochimique in situ. Le principe consiste à suivre, pendant l’amplification PCR de la séquence cible, la décroissance exponentielle de la réponse électrochimique d’une sonde redox libre capable de s’intercaler au fur et à mesure de l’amplification dans l’ADN double brin amplifié.

L’instrument se compose d’un thermocycleur avec un bloc de chauffe à effet Peltier, à plat, sur lequel vient se positionner une microplaque formée de 48 micro-puits électrochimiques indépendants (équipés chacun, sur leur fond plat, de trois électrodes sérigraphiées), le tout étant relié à une simple carte électronique (potentiostat) capable d’interroger (par multiplexage) le contenu de l’ensemble des 48 micro-puits à l’aide d’une technique de voltamétrie à vague carrée. Avec ce dispositif, il devient alors possible de suivre en temps réel et en parallèle jusqu’à 48 solutions PCR.

Avec ce premier développement, il a été possible de démontrer des performances analytiques (limite de détection : < 10 copies par puits ; dynamique de concentration > à 8 ordres de grandeurs) proches de celles obtenues avec des appareils commerciaux équipés d’une détection de fluorescence.

Le faible coût instrumental mais aussi le faible coût de fabrication des microplaques électrochimiques, ainsi que la possibilité de miniaturiser et d’intégrer le tout dans un appareillage robuste, de faible encombrement, ouvre des perspectives très prometteuses pour l’exploitation de cette nouvelle technologie dans de nombreux domaines nécessitant la détection rapide, sensible et spécifique d’ADN.